支原体是一种大小仅为0.2~0.3 um，无

细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um）的原核生物，在细胞培养过程中，支原体感染发生率达到63%，因而细胞培养过程中被支原体污染是一个世界性的难题。当细胞（特别是传代细胞）被支原体污染后，细胞内的DNA、RNA及蛋白表达发生改变，而细胞的生长率一般并未发生显著的影响，因而细胞被支原体污染一般难以察觉。 一般根据支原体种类不同，采取不同的方法进行检测。目前常用的检测方法有：

1. 试剂盒检测法：

目前已有专门做支原体检测的试剂盒，可以用细胞滴片进行检测。

2. 观察细胞的形态和生长特征：

支原体污染比较严重时可出现生长减慢，有的培养基pH明显变酸，并出现细胞病变，以此可依次对支原体污染进行检测，但有些情况下支原体污染引起的病变特征与病毒感染相似，因此不能准确诊断。

3. 分离培养法：

大多数支原体可出现特有的典型菌落。因而可依次尽心检测，该方法准确、可靠，但时间长，敏感性不够高。

4. DNA结合荧光素染色法：

利用荧光染剂（bisbenzimide,Hoechst 33258）侦测支原体污染。荧光染料会结合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich区域，因为支原体DNA中A-T含量占多数（55～80%），所以可将其染色而侦测。被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之荧光小点，即为支原体之DNA，证明有支原体之污染。

5. 电子显微镜和免疫电子显微镜法：电子显微镜或者免疫电镜下对样本进行观察，此法较准确，但受条件限制，时间长，敏感性不高。

6. 间接免疫荧光法和免疫印迹：简便、快速、特异性强。

组织细胞培养工作中，可以从以下几方面来预防支原体的污染：

控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌；在细胞培养基中加入适量的抗生素。

当细胞被支原体污染后若由于材料的特殊性必须保留可以采用一定的抗生素进行处理，对支原体最有抑制活性抗生素是四环素类、大环内酯类等。目前，市场上已有了新一代支原体抗生素M-Plasmocin，能有效的杀灭支原体，又不影响细胞本身的代谢，而且处理过的细胞不会重新感染支原体。另外，配合支原体检测试剂盒可以帮助尽快发现支原体的污染。 1、支原体size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um）

2、支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化

3、过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式

4、细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染

5、研究或操作人员忽略污染问题

去除支原体污染

1、抗生素处理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer）

2、Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine

3、Anti-sera 设备方面：

1、使用已作支原体测试ok之细胞株

2、于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞

3、使用不添加抗生素的培养基培养细胞

检测方面：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。

实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求 1、应如何避免细胞污染？

细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。

2、如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？

直接灭菌后丢弃之。

3、支原体(mycoplasma) 污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？

不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。

4、支原体污染会对细胞培养有何影响？

支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。

5、侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？

直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。 直接培养法

原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。

特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。

缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来(例如M. hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。

材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸（厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应用无菌水，每次打开厌氧缸后，用70% ethanol擦拭内壁。）

培养基制备：

基本配方为Difco PPLO broth(60%), 马血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培养时间长，可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1：2000)至培养基中以防止其它细菌污染。

· 10x stock solution (1 liter) ：称取50 gdextrose，10 gL-arginine HCl，溶于1 liter蒸馏水中。以0.22μm无菌过滤膜过滤灭菌。分装100 ml至瓶中，保存于-70℃。

· 液体培养基(1 liter) ：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 gphenol red 于600ml蒸馏水中，加热搅拌溶解之。灭菌121℃，15分钟。待温度降低至室温后，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution，及100ml解涷之10x stock solution，混合均匀后，分装至已灭菌之有盖螺旋试管中，10ml/管。保存于4℃，期限1个月。

· 固体培养基(1 liter )：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 gphenol red，15gBacto agar于600ml蒸馏水中，加热溶解之。灭菌121℃，15分钟。放在50℃水中浴中，待温度降低至50℃时，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解冻之10x stock solution，混合均匀后，倒入60x50㎜之无菌培养皿中，5ml/培养皿。保存于4℃，期限1个月。

步骤：

· 取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，接种于液体培养基中，置于37℃培养二周，观察是否有混浊或是pH值改变之情形。培养一周及二周后，分别取0.1 ml液体培养液涂在agar plate上，将其倒放置于37℃厌氧箱培养，培养至少3星期，持续观察是否有支原体之菌落出现。

· 另取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，涂抹在agar plate上，37℃厌氧培养3星期，持续观察是否支原体菌落出现。

· 另作正负反应对照组，正反应对照组为Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 与M. arginini (ATCC 23838)。负反应对照组为待测细胞之新鲜培养基。